La colorazione con metodi a base di fenolo e zolfo è utile in un’ampia gamma di contesti di laboratorio. In particolare, la colorazione è comunemente utilizzata per rilevare e identificare DNA e RNA. La tecnica preferita per questi scopi è il kit di colorazione GEMSTAIN® Phenol-Sulfur di Promega. In questo articolo, discuteremo le basi del funzionamento di GEMSTAIN e alcune applicazioni comuni.
Per cosa si usa GEMSTAIN?
GEMSTAIN viene utilizzato per rilevare e identificare diversi tipi di molecole, tra cui DNA e RNA. Il kit contiene quattro reagenti per l’incubazione della colorazione: 0,1% blu di metilene, 0,1% cloruro di calcio, 0,025% tioglicolato di sodio e 1% solfato di sodio.
I reagenti reagiscono tra loro creando una macchia blu e bolle di solfato, ma non DNA o RNA. Il DNA e l’RNA colorati all’interno della cellula sono visibili al microscopio. È possibile utilizzare il DNA e l’RNA colorati per confrontarli con GenBank o con qualsiasi altro database di acidi nucleici.
Componenti del kit di colorazione
GEMSTAIN è composto da quattro reagenti che vengono aggiunti a una soluzione di alcol fenolico. I reagenti vengono poi aggiunti a un tampone di reidratazione composto da etanolo al 99%, cloruro di calcio allo 0,1% e acido tioglicolico allo 0,025%. Dopo la reazione dei reagenti, la soluzione viene centrifugata. La soluzione finale viene quindi colorata. Il DNA e l’RNA sono visibili al microscopio perché sono fluorescenti.
Come funziona?
GEMSTAIN utilizza una tecnica innovativa che si basa sulla reazione di quattro reagenti all’interno di una soluzione di alcol fenolico. Il DNA e l’RNA non sono presenti nella soluzione e quindi non si colorano, invece, il DNA e l’RNA all’interno della cellula colorata diventano parte della reazione e colorano la soluzione.
La preparazione della soluzione di colorazione GEMSTAIN è il primo passo. I quattro reagenti vengono aggiunti a una soluzione di alcool fenolico, vengono poi aggiunti a un tampone di reidratazione composto da etanolo, cloruro di calcio e acido tioglicolico. Il tampone riduce la possibilità che i reagenti si aggreghino. Dopo la reazione dei reagenti, la soluzione viene centrifugata per separare i componenti rimanenti.
La soluzione centrifugata viene quindi colorata. Il DNA e l’RNA sono visibili al microscopio perché sono fluorescenti. Il DNA e l’RNA colorati possono essere utilizzati per il confronto con GenBank o con qualsiasi altro database di acidi nucleici.
Vantaggi del metodo di colorazione con fenolo-zolfo
- Distruttivo – il DNA e l’RNA non sono presenti nella soluzione colorata, quindi non contaminano o danneggiano altri campioni.
- Specifico – è specifico perché colora solo il DNA e l’RNA.
- Efficiente – è efficiente perché utilizza solo quattro reagenti e una soluzione di alcol fenolico.
- Economico – è economicamente vantaggioso perché utilizza solo una piccola quantità di reagenti.
- Basso rischio -non presenta effetti collaterali ad alto rischio come cancerogenicità, mutagenicità o tossicità.
- Nessuna attesa – è veloce perché utilizza solo quattro reagenti.
- Facile trascrizione – è facile da trascrivere perché si basa su una soluzione fenolo-alcolica.
Svantaggi del metodo di colorazione fenolo-zolfo GEMSTAIN
- Utilità limitata – è utile solo per rilevare e identificare DNA e RNA.
- Costo – i reagenti sono costosi e non sempre disponibili.
- Competenze tecniche – richiede competenze tecniche.